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| 巨细胞病毒感染 |
诊断编辑本段回目录
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一、病毒分离
最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应在1天或数周后出现，经固定和HE染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（owl′s eye）亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。
二、血清抗体检测
最常用的有补体结合试验、间接免疫荧光试验、免疫酶试验、间接血凝试验和放射免疫试验等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。
三、DNA探针
已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。
四、聚合酶链式反应
（一）标本的采集及处理
采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层（buffy coats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。
尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇（PEG6000）进行预处理：50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。
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1、由血液标本制备模板DNA
方法A：向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。
方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备：
① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。
② 加入500μl 6mol/L盐酸胍，匀浆。
③ 加入30μl 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。
④ 加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。
⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃备用。
2、由冰冻组织标本制备模板DNA：
① 用恒冷切片机切取一块5～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。
② 加入10%用缓冲液配制的福马林。
③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。
④ 于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100μl ）；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。
⑥ 37℃放置过液。
⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。
⑧ 离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。
3、由尿液标本制备模板DNA：
①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。
② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。
③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。
④ 同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。
⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。
⑥ 15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。
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引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。
（四）PCR扩增步骤
1、10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。
Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。
10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。
引物：100pmol/L。
2、常规PCR扩增
10×反应混合物（50μl）反应缓冲液 5μl
10×dNTP 5μl
模板DNA 5μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)
引物 各0.5μl
蒸馏水 3.8μl
加1～2滴矿物油。
将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。
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（五）产物鉴定
扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。
1、 固相杂交：
① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。
② 加入标记探针（10cpm/μg，2ng/ml），杂交30～60min。
③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。
④ 自显影。
2、 液相杂交及电泳分析：
① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。
② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl 。
③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。
④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
⑤ 电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。
HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。
在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。
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PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。
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发病机理编辑本段回目录
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一、对胸腺、脾脏的影响
实验室急性CMV感染的新生豚鼠，胸腺发育受抑，T细胞数减少，成年鼠感染CMV后，88%胸腺可检出CMV。
CMV感染致脾功能受影响，脾脏淋巴细胞对conA刺激的增殖下降，脾细胞产生的IL-2显著降低。
二、对免疫细胞的影响
CMV感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的单核细胞中复制，其中单核吞噬细胞最易感染CMV，淋巴细胞在免疫反应中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后，可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。
CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周血淋巴细胞对有丝分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反应减弱，诱导干扰素水平下降，CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月，大多数患者T细胞亚群比例仍未完全恢复正常。
CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大单核细胞和CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV免疫中起着枢纽作用，不但可以直接吞噬、杀伤病毒，更重要的是可以处理、提呈抗原，分泌细胞因子，调控和扩大免疫反应。当CMV感染后，单核吞噬细胞功能受到影响，CMV感染巨噬细胞引起其吞噬功能降低，细胞内氧自由基产生减少，FC受体、补体受体的表达发生改变，且其抗原提呈功能降低，产生IL-1降低，对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用胸腺细胞增殖试验检测，IL-1活性降低，IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。
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三、抗体有降低CMV感染的毒力作用
机体受CMV的感染后，可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有特异性抗体出现，包括中和抗体。但仍能检出CMV，说明抗体并不能阻止病毒扩散。胎儿从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明，致死性CMV攻击前，在小鼠腹腔或静脉注入0.2ml高效价抗CMV球蛋白，可完全保护动物免于死亡。1个月后再用CMV等二次攻击，动物仍全部存活，表明抗体有降低CMV的毒力作用。
初次感染后，CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官，尸检提示肺、肝、胰、唾液腺、中枢神经系统及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度，与缺乏产生沉淀抗体的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后，在外周血中出现具有抑制细胞毒表型的活化T淋巴细胞，如果宿主的T细胞功能受损，潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。组织移植后发生的慢性刺激，为CMV活化，诱发疾病提供了条件。某些针对T细胞的强烈免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白，与临床CMV症候群高发率有关。此外，CMV在功能上可作为辅助因子，使潜伏感染的HIV活化。
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