载脂蛋白纯品的鉴定 |
概述编辑本段回目录
ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一,对血脂代谢起重要的调节作用。近年来研究发现,ApoE基因多态性与年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)、单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)等眼科疾病有着密切的关系。
结构编辑本段回目录
载脂蛋白AI、B(ApoAI、B) |
Apo E的一级结构是一条单多肽链, 其全部的氨基酸组成顺序已经被Apo E mRNA的cDNA分析所证实。其氨基酸组成上含有10%~12%的精氨酸(按其氨基酸克分子计算),故曾称为富含精氨酸载脂蛋白。有关Apo E的二级结构已基本弄清,对其三级结构也有部分了解。Apo E是一个多态性蛋白,有三个常见的异构体 , 即E2、E3和E4。各种Apo E异构体的主要区别是氨基酸一级结构的不同, 这涉及到半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)的交换: E3含一个Cys(第112位);E4不含Cys, 但比E3多一个Arg(第112位);E2含2个Cys, 但比E3少一个Arg(第158位)。Apo E 的二级结构中含有较多的α-螺旋,这种结构在去垢剂或脂类环境中仅有极微小的改变 , 是比较稳定的。同其他载脂蛋白(如AI、AII、CII)相比较,Apo E有易变的、松散的、折迭三级结构。
Apo E羧基未端的稳定区可能是主要的脂蛋白脂类结合区,此区没有与LDL受体结合的活性。而Apo E氨基未端区具有很强的与LDL受体结合的能力。通过酶和化学切开的Apo E分子碎片基因研究表明,Apo E的受体结合区域存在于N端126-191氨基酸残基端区域之间。LaLazar等研究表明,Apo E的N端140-160氨基酸残基附近区域,对于受体的结合是非常得要的。特别是这一部位的硷性氨基酸如精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)是Apo E结合受体所必需的。这一区域中仅一个氨基酸的取代就可影响受体的结合活性。用一些中性氨基酸分别取代136、140、150等位置上的碱性氨基酸,可出现不同的受体结合活性,约为正常的9%~25%(Apo E3为100%) 。 如果使 Apo E139位的色氨酸(Ser)变为Arg、149位的亮氨 酸(Leu)变为 甘氨酸(Ala),却表现出结合活性的轻微增加。
载脂蛋白e基因多态性与轻度认知障 |
通过对LDL受体的研究也证明了这一点,在LDL受体结构区I含有成簇的带负电荷的氨基酸,是Apo E带正电荷的氨基酸残基的特异结合部位。用抗结合部位的Apo E单克隆抗体研究也表明Apo E140-160 氨基酸残基为受体结合的残基。这一区域的结构包括: α-螺旋(131-150)、β转角(151-154)和β-折迭(155-162)。
Apo E除具有与LDL受体结合的能力外, 还可以与Apo E受体结合。Apo E受体只能与Apo E结合, 它只存在于肝脏。Apo E受体对LDL受体抗体有交叉免疫性 , 但Apo E受体抗体不与LDL受体反应。这说明Apo E受体中有特殊的抗原决定簇, 这种抗原决定簇在LDL受体中并不存在。
人Apo E基因已被分离出来,基因定位于19号染色体上。Apo E基因由3597个核苷酸组成,含有4个外显子和3个内含子。四个外显子的长度分别为44、66、193 和860bp;三个内含子的长度分别为760、1092和582bp。相对应的Apo E mRNA由 1169个核苷酸组成。
多态性编辑本段回目录
人类Apo E有三种主要的异构体(E2、E3、E4),他们之间的差别仅在于112 位和158位上的单个氨基酸不同,即半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)相互取代(E2为112 位和158位上均是Cys,E3为112位上是Arg158位上是Cys,而E4则为112位和158位上均是Arg)。这种单个氨基酸不同造成的异构体就是由于Apo E基因的多态性所决定的。已知的常见Apo E异构体是由三个等位基因编码,人群中有六种表型,即三种纯合子如E2/E2、E3/E3和E4/E4以及三种杂合子如E4/E3、E4/E2和E3/E2。在不同的人群中三个不同的Apo E等位基因(Ε2、Ε3、Ε4)分布频率存在不同, 因而决定了不同人群中Apo E表型的频率差异。
生物学特性编辑本段回目录
1、结构及基因多态性 ;ApoE是一种分子量为34kDa的糖蛋白,由299个氨基酸组成,是Shore等于1973年首次发现的。1975年确认其多态性,并依字母顺序将其命名为ApoE。人类ApoE基因具有显著遗传多态性,位于第19号染色体长臂13区2带,基因全长3.7kb,包含4个外显子和3个内含子,由单个碱基替换产生ApoE基因多态性。ApoE有3种复等位共显性基因:ε 2、ε 3、ε 4,每个基因对应一个亚型,产生6种表型:3种纯合子E2/2、E3/3、E4/4和3种杂合子E2/3、E3/4、E2/4,另外还有极少见的亚型。自然人群中,ε 3基因频率分布最高,ApoE3纯合体表型分布频率约为70%。含E3的杂合子(E4/3E3/2)居中,二者之和不超过20%,E2/2、E4/4表型频率最低,二者之和不超过8%。
载脂蛋白(APO)研究方案
2、体内分布及功能 ;ApoE可以在各种组织中合成,在肝脏中合成最多,其血浆浓度约为30~50mg/L,ApoE在肝脏中的含量约占血浆总量的2/3~3/4,其次在脑组织中合成亦较多。ApoE主要存在于极低密度脂蛋白(very low density lipoproteins,VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、乳糜微粒(chglomicrons,CM)及CM残骸中。ApoE可与脂质及其受体(包括LDL受体、VLDL受体及LDL受体相关蛋白)结合,ApoE作为配体参与受体介导的载脂蛋白清除过程。如经低密度脂蛋白受体(low densitu lipoprotein receptor,LDLR)介导VLDL和LDL的清除,经LDLR和低密度脂蛋白受体相关蛋白(receptor relaled protein, LRP)介导CM的清除。ApoE与总胆固醇(TC)转运、TC再分布、免疫调节和细胞增殖分化等功能有关,是中枢神经系统重要的载脂蛋白和代偿突触形成过程中胆固醇和脂类转运的重要调节因子。
生理功能编辑本段回目录
(一)、组成脂蛋白, 是CM、VLDL、IDL和部分HDL的结构蛋白;
(二)、作为配体与LDL受体和Apo E受体结合;
(三)、具有某种免疫调节作用,这是因为在淋巴细胞表面有Apo E免疫调节受体,而含Apo E的脂蛋白能与淋巴细胞免疫调节受体结合,可使淋巴细胞对促进细胞分裂的刺激发生对抗,这可能是脂蛋白和受体的结合抑制了淋巴细胞活化所需要的早期转化过程,如对钙的摄取、磷脂酰肌醇循环和环核苷酸代谢等。这些观察提示Apo E在免疫反应中可能有一定的调节作用。
(四)、参与神经细胞的修复。
基因型编辑本段回目录
载脂蛋白E等位基因和SDB风险因子的关系 |
人群中甘油三酯水平与Apo E表型间亦有较明确有关系, 即E2/E2 、 E3/E2 、E4/E3和E4/E2者的血浆甘油三酯水平明显高于E3/E3者。同时还发现E4/E4者 HDL-C浓度明显 低于E3/E3者。
Apo E的多态性也可影响各类高脂蛋白血症患者的血脂和脂蛋白水平,最典型的范例是 Apo E2/E2 表型与家族性异常β脂蛋白血症 ( familial dysbetalipoproteinemia,FD)相伴随。绝大多数FD患者为Apo E2/E2表型, 故后者被认为是FD发病的必备条件。有研究表明,Apo E2/E2表型者,无论其血浆总胆固醇浓度的高低如何,都伴有VLDL结构异常(富含胆固醇酯)、血浆IDL浓度升高和 LDL浓度降低。
体内代谢研究结果表明,Apo E2和E4的代谢不同于Apo E3。将用同位素标记的Apo E2和Apo E3注射入Apo E3/E3的个体内, 发现Apo E2与VLDL、IDL和HDL 结合较少,而是较多地存在于HDL中或游离在血浆中, 并且 E2 自身的分解代谢缓慢。而Apo E4的体内代谢情况则恰恰相反。Apo E 各表型在体内的代谢不同与临床上测定各表型者血浆Apo E浓度有一致的关系: E2/E2者血浆Apo E浓度最高, E3/E3者居中,而E4/E4者最低。
关于Apo E表型调节体内血浆脂蛋白代谢的机理,目前认为是由于Apo E2 与脂蛋白受体结合的能力低下, 引起CM和VLDL残粒分解代谢延缓, 造成这些残粒在体内蓄积;同时也因IDL向LDL转化减少, 造成血浆中IDL浓度增加和LDL浓度低下。这些改变使CM和VLDL残粒进入肝细胞内代谢减少,肝细胞内游离胆固醇含量减少, 反馈调节性地引起肝细胞表面上的LDL受体上调(数目增加),因而加速LDL在体内的分解代谢, 使血浆LDL浓度进一步低下。如果没有其他可引起血脂升高的遗传和/或环境因素并存, Apo E2的尽效应则是使血浆甘油三酯水平升高, 而使血浆胆固醇水平降低。与此相反, Apo E4与受体的结合能力则相对较强,因而使CM和VLDL残粒代谢增速,使IDL向LDL的转化也增多。其结果是引起血浆中CM残粒、VLDL和 IDL水平下降,而LDL水平升高。由于正常情况下, 体内CM和VLDL残粒水平很低, 故Apo E4 对这些脂蛋白残粒的影响难以被察觉。所以, Apo E4的尽效应是造成血浆胆固醇水平升高,而对血浆甘油三酯水平的影响则不大。
Apo E表型还可能通过其他途径来影响体内血脂水平。有人发现,Apo E4携带者,小肠吸收胆固醇增加。所以, Apo E4携带者采用饮食疗法治疗高脂血症获益最明显。另有实验发现, Apo E2携带者体内脂肪酸合成明显高于Apo E3者, 并认为这种体内脂肪酸合成增加是Apo E2者易伴发高甘油三酯血症的主要原因。
溶血卵磷脂对载脂蛋白E基因 |
有关Apo E表型与冠心病关系的研究结果很不一致,可能是由于被研究者常同时存在高胆固醇血症、高血压病、糖尿病和吸烟等冠心病的主要危险因素。若能在无危险因素存在的中青年心肌梗塞存活者中进行Apo E等位基因频率分析,则可望获得较为有说服力的结果。
调查12866例存在冠心病高危因素的中年男性, 发现冠心病组Apo E3/E3频率分布为0.462, 较对照组(0.67)显著为低, 提示Apo E3/E3表型者不易患冠心病。而冠心病组Apo E4/E3分布为0.333, 较对照组(0.206)显著为高, 提示Apo E4/E3表型者有易患冠心病的倾向。经对比线性回归单因素分析, 提示Apo E3/E2 、 E4/E3 和E4/E4 表型者患冠心病的危险性增加。 国内的研究结果亦支持冠心病患者中 Apo E4/E4的频率分布较高。
观察100例缺血性脑卒中的男性病人,发现其Apo E4 等位基因的频率明显高于对照组, 故认为Apo E等位基因携带者很可能具有缺血性脑血管疾病的遗传易感性。然而, 另一组研究则提示Apo E2等位基因可能是缺血性脑卒中的危险因素。
还有几组研究报道在老年性痴呆患者中Apo E4/E4表型者频率异常高,提示Apo E的多态性也可能与神经系统疾病之间存在一定的关系。
病状详解编辑本段回目录
1、与年龄相关性黄斑变性 ;
细胞溶酶体融合,载脂蛋白被水解 |
年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)是西方国家首要的不可逆的致盲眼病,虽然目前病因尚不明确,但已发现许多与之相关的危险因素,最近研究结果关于ApoE基因与AMD发病的报道颇多,各持己见。实验发现,ApoE在视网膜组织,特别是RPE和Bruch’s膜上有表达,此位置正是AMD的病变区域。Dithmar等发现膜结合物质在ApoE缺乏鼠的玻璃膜中明显增多,测量玻璃膜厚度,显著高于正常对照组,认为ApoE缺乏或血浆脂质水平增加或RPE水平效应是玻璃膜超微结构改变的直接原因。膜结合物质是基底线沉积物(basal line deposition,BLD)和大玻璃膜疣的主要成分。光镜、电镜检查发现ApoE缺乏鼠的视网膜内、外核层细胞数量明显降低,外核层细胞核染色质浓缩,核周空泡形成,玻璃膜增厚,弹力层不连续甚至结构不清,从而发生AMD的眼底损害。Kliffen等证实携带ApoE3鼠的高脂饮食组,其BLD有不同程度增加;正常饮食组,BLD也有少量沉积;ApoE基因敲除组则未发现BLD存在,证实ApoE功能障碍参与AMD细胞外沉积物形成,对AMD发病起一定作用。
临床上多数研究倾向于ε 4等位基因对AMD有保护作用,而ε 2则可加速疾病发展。Baird等在研究中调整了年龄和性别后,晚期AMD的ε 3/4基因型与ε 3/3基因型患者相比,前者患病率降低近一半;将晚期AMD分成萎缩型和新生血管型,则ε 3/4基因型对萎缩型AMD保护作用最强;晚期AMD的男性ε 3/4基因型者患病危险性降低近3倍。而在疾病诊断年龄上,晚期AMD的ε 2/3基因型较ε 3/3基因型者明显提前(3.4a),以女性和新生血管型AMD最明显(分别是3.9a和4.7a)。当将有家族史的萎缩型患者再分类,发现这些患者ApoE ε 4等位基因全部缺失,认为ε 4等位基因在萎缩型AMD的保护作用优于新生血管型,提出ApoE等位基因是AMD发病的一个因素,ε 4等位基因起保护作用,至少可延迟AMD诊断时间,ε 2等位基因在加速疾病进程上起修饰基因的作用。
Zareparsi,Schmidt等也有相关报道。Thakkinstian等对1966/2005年MEDLINE的所有有关基因的报道综合分析表明,ε 2、ε 4等位基因在高加索人群的出现频率为8%和15%。基础等位基因和基础表型相关检测表明ε 2危险作用达20%,ε 4的保护作用达到40%。虽然要排除生存偏倚的可能性,但ε 2和ε 4等位基因在AMD中确实表现出不同的作用。还有研究认为有吸烟史的ε 2等位基因携带者患湿性AMD的危险性高于ApoE4和 ApoE3/3型携带者。而Asensio?Sánchez等的研究却得出相反结论,他对西班牙95例AMD患者检测后发现ε 4等位基因使AMD患病风险增加5倍多,且在70~75岁患者中表现明显。 Pang等对研究了98例中国AMD患者后发现在渗出型AMD患者中ApoE4基因产物虽有所下降,但下降趋势不明显,分析中国人ApoE4等位基因分布频率较欧洲人低,因故还不能认为ApoE4与AMD有直接关系。Gotoh等分析了日本82例健康人、58例息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)及85例AMD患者的ApoE基因型及等位基因频率,发现PCV患者和AMD患者存在ApoE2和ApoE4多态性的较少,其基因型和等位基因频率与正常人比较亦无显著差异。因此考虑可能存在种族、地域、筛查的人群等因素,使ApoE基因与AMD的关系尚存争议,仍待临床长期大量研究。
2、与单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK):
有研究发现1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV 1)潜伏在ApoEε4携带者的颅神经内更易损伤神经系统,促使阿尔茨海默病(alzheimer s disease,AD)发生,被视为AD发病的一个危险因素,那么由HSV引起的HSK是否与ApoE有关呢?Lin等对46个HSK患者和238个正常对照组进行ApoE基因检测,结果HSK患者ε 4基因频率占15%,与对照组频率相等,而ε 2基因频率占13%,虽然高于正常对照组(7%),但无统计学意义(P=0.06)。分析认为ApoE2和其它亚型相比与角膜细胞结合能力较弱,因此病毒易于侵入角膜,使ApoE2携带者角膜损伤更重。或者,角膜细胞膜受体与ApoE和HSV1的结合方式与神经元细胞受体有所不同。
此后临床上未见关于HSV与ApoE基因关系的报道。最近Bhattacharjee等展开了一系列关于ApoE与HSV1的实验研究,并首次报道ApoE4是HSK发病的一个危险因素。起初,Bhattacharjee等采用角膜划痕法对ApoE基因敲除(ApoE/)雌鼠和年龄等大的C57BL/6(ApoE+/+)雌鼠接种HSV1菌株 17Syn+,接种5d后发现两组鼠角膜均感染了HSV1病毒,实时PCR数据显示,ApoE(/)鼠的HSV1 DNA数量明显低于ApoE(+/+)对照组,且对照组14只鼠中有7只因感染17Syn+而死亡,ApoE(/)鼠则无一死亡,说明携带ApoE基因的鼠更易感染HSV 1病毒,而ApoE(/)鼠对病毒抵抗力更强,病毒的潜伏时间更短。推测ApoE基因可影响HSV1病毒的活性。随后另一项实验又以10g/L ApoE二聚体肽(ApoEdp)对C57BL/6雌鼠角膜成功接种HSV1 菌株 KOS GFP 24h后进行治疗,发现与安慰剂组相比,ApoEdp可显著降低HSK的发病率,抑制病情发展,认为ApoEdp通过大幅下调鼠促炎细胞因子表达,达到抗HSV1和抗炎效果。并在转基因鼠模型实验中发现,ApoE4可上调角膜中VEGF表达,增强蛋白酶解作用,使ApoE4鼠眼部病毒迅速复制,角膜较早就发生混浊,且新生血管化程度高,在三叉神经节和脑中的HSV1 DNA含量亦较ApoE3鼠多。此系列实验使人们对ApoE基因在 HSK的作用机制的方面有了新的认识。
3、与原发性视网膜色素变性:
脂蛋白肾小球病——由载脂蛋白e变 |
4、与白点状视网膜变性:
白点状视网膜变性临床较少见,也是一种遗传性视网膜色素变性。有研究对一患有白点状视网膜变性的家族进行基因检测,发现此家族中所有患者均发生视紫红质基因Arg135Trp突变,且均携有ApoE4等位基因,外周/RDS或ROM1基因未发现变异,提示本病发生不只与外周/RDS基因突变有关,ApoE基因也可能起着作用。
ApoE基因与眼病的关系远不止上述,相信在不远的将来会有更多关于ApoE基因与眼病的研究成果呈现在眼科学者面前,为眼病的发病机制及治疗提供依据。